Sterilisasi Alat dan Bahan Pada Pengujian Mikrobiologi

Posted: 21 Oktober 2010 in all about my task

STERILISASI ALAT DAN BAHAN PADA PENGUJIAN MIKROBIOLOGI

 

A. TUJUAN
• Memahami dan melaksanakan proses sterilisasi yang tepat dan sesuai untuk alat dan bahan yang akan digunakan dalam pengujian.
• Mampu menyiapkan dan membuat media steril untuk pengujian.

B. TEORI DASAR
Sebelum melakukan percobaan dengan mikroorganisme, diperlukan proses dekontaminasi terlebih dahulu untuk meminimalisir organisme yang aktif dari suatu sistem bakteri atau virus. Dekontaminasi adalah proses menghilangkan atau membunuh mikroorganisme sehingga objek aman untuk ditangani, tujuannya untuk melindungi praktikan yang melakukan percobaan menggunakan bakteri atau semacamnya. Ada beberapa metode dekontaminasi, yaitu:
1. Sterilisasi : proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya.
2. Desinfeksi : metode untuk memusnahkan atau menghancurkan mikroorganisme patogen.
3. Sanitasi : metode untuk mengurangi tingkat organisme yang hidup.
Beberapa mikroorganisme memiliki resistensi terhadap dekontaminan kimia, seperti : bakteri vegetatif, jamur, dan virus yang mengandung lipida relatif yang mudah didekontaminasi dengan senyawa kimia. Virus yang tidak mengandung lipida dan bakteri berlapis lilin memiliki tingkat resistensi tinggi. Resistensi terhadap dekontaminan kimia dipengaruhi beberapa faktor, seperti : konsentrasi dari zat aktif, lamanya kontak, pH, suhu, kelembapan, dan kehadiran senyawa organik. Inaktivasi mikroorganisme dengan dekontaminan kimia dapat melalui mekanisme sebagai berikut :
Koagulasi dan denaturasi protein
Lisis
Ikatan dengan enzim atau destruksi substrat enzim
Oksidasi

Hal penting yang harus diperhatikan dalam melakukan dekontaminasi :
1. Target mikroorganisme.
2. Dekontaminan yang digunakan (bentuk dan target yang diinginkan).
3. Tingkat inaktivasi yang diperlukan.
4. Adanya substrat organik seperti darah, agar, dsb.
5. Tipe permukaan dari target seperti : padat, berpori atau mudah diterbangkan udara.
6. Konsentrasi tertinggi dari sel yang dapat ditanggulangi dengan inaktivasi.
7. Kemampuan dekontaminan kontak dengan mikroorganisme.
8. Prosedur antisipasi yang diperlukan dalam dekontaminasi agar efisien dalam waktu dan konsentrasi yang digunakan.
9. Toksisitas dari dekontaminan yang dapat membahayakan praktikan di area tersebut.

Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya. Ada 5 metode umum sterilisasi, yaitu :
1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab)
2. Sterilisasi Panas Kering
3. Sterilisasi dengan Penyaringan (Filtrasi)
4. Sterilisasi Gas
5. Sterilisasi dengan Radiasi
Metode yang biasa digunakan untuk sterilisasi alat dan bahan pengujian mikrobiologi adalah metode sterilisasi uap (panas lembab) dan metode sterilisasi panas kering.
1. Sterilisasi Uap (Panas Lembab)
Sterilisasi Uap dilakukan menggunakan autoclave dengan prinsipnya memakai uap air dalam tekanan sebagai pensterilnya. Temperatur sterilisasi biasanya 121℃, tekanan yang biasa digunakan antara 15-17,5 psi (pound per square inci) atau 1 atm. Lamanya sterilisasi tergantung dari volume dan jenis. Alat-alat dan air disterilkan selama 1 jam, tetapi media antara 20-40 menit tergantung dari volume bahan yang disterilkan. Sterilisasi media yang terlalu lama menyebabkan :
1. Penguraian gula.
2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino.
3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar.
Bila ada kelembapan (uap air) bakteri akan terkoagulasi dan dirusak pada temperatur yang lebih rendah dibandingkan jika tidak ada kelembapan. Mekanisme penghancuran bakteri oleh uap air panas adalah terjadinya denaturasi dan koagulasi beberapa protein esensial dari organisme tersebut.
Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi uap dengan menggunakan autoclave adalah :
– Suhu 115,5 ℃, waktu 30 menit
– Suhu 121,5 ℃, waktu 20 menit
– Suhu 126,5 ℃, waktu 15 menit
Metode sterilisasi uap umumnya digunakan untuk sterilisasi sediaan farmasi dan bahan-bahan lain yang tahan terhadap temperatur yang dipergunakan dan tahan terhadap penembusan uap air, larutan dengan pembawa air, alat-alat gelas, pembalut untuk bedah, penutup karet dan plastik, dan media untuk pekerjaan mikrobiologi.
2. Sterilisasi Panas Kering
Sterilisasi Panas Kering dilakukan menggunakan oven pensteril, karena metode sterilisasi panas kering kurang efektif untuk membunuh mikroba dibandingkan dengan sterilisasi uap. Metode ini memerlukan temperatur yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang, sterilisasi panas kering biasanya ditetapkan pada temperatur 160-170 ℃ dengan waktu 1-2 jam. Umumnya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak efektif untuk disterilkan dengan uap air, seperti minyak lemak, minyak mineral, gliserin (berbagai jenis minyak), petrolatum jelly, lilin, wax, dan serbuk yang tidak stabil dengan uap air. Metode ini efektif untuk mensterilkan alat-alat gelas dan bedah.
Karena tingginya suhu yang diterapkan dalam sterilisasi panas kering, maka metode ini dapat digunakan untuk alat-alat gelas yang membutuhkan keakuratan. Contohnya alat ukur dan penutup karet atau plastik. Kondisi yang dibutuhkan untuk sterilisasi panas kering dengan menggunakan oven steril adalah :
Suhu 170°C, waktu 1 jam
Suhu 160°C, waktu 2 jam
Suhu 150°C, waktu 2,5 jam
Suhu 140°C, waktu 3 jam

Prinsipnya adalah protein mikroba pertama-tama akan mengalami dehidrasi sampai kering. Selanjutnya teroksidasi oleh oksigen dari udara sehingga menyebabkan mikrobanya mati.

3. Sterilisasi dengan Penyaringan (filtrasi)

Sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi) digunakan untuk sterilisasi larutan yang termolabil, penyaringan ini menggunakan filter bakteri. Metode ini tidak dapat membunuh mikroba, mikroba hanya akan tertahan oleh pori-pori filter dan terpisah dari filtratnya. Dibutuhkan penguasaan teknik aseptik yang baik dalam melakukan metode ini. Filter biasanya terbuat dari asbes, porselen. Filtrat bebas dari bakteri tetapi tidak bebas dari virus. Cara kerja dari sterilisasi ini berbeda dari metode lainnya karena sterilisasi ini menghilangkan mikroorganisme melalui penyaringan dan tidak menghancurkan mikroorganisme tersebut. Penghilangan mikroorganisme secara fisik melalui penyaring dengan matriks pori ukuran kecil yang tidak membiarkan mikroorganisme untuk dapat melaluinya. Cara sterilisasi ini untuk produk berupa cairan yang dapat disaring atau bahan yang tidak tahan terhadap panas dan tidak dapat disterilkan dengan cara sterilisasi lain. Teknologi tinggi membran filtrasi meningkatkan penggunaan sterilisasi filtrasi, khususnya jika digunakan berpasangan dengan sistem proses aseptik.
4. Sterilisasi Gas
Sterilisasi gas digunakan dalam pemaparan gas atau uap untuk membunuh mikroorganisme dan sporanya. Meskipun gas dengan cepat berpenetrasi ke dalam pori dan serbuk padat, sterilisasi adalah fenomena permukaan dan mikroorganisme yang terkristal akan dibunuh. Sterilisasi yang digunakan dalam bidang farmasi untuk mensterilkan bahan-bahan dan menghilangkan dari bahan yang disterilkan pada akhir jalur sterilisasi, gas ini tidak inert, dan kereaktifannya terhadap bahan yang disterilkan harus dipertimbangkan misalnya thiamin, riboflavin, dan streptomisin kehilangan protein ketika disterilkan dengan etilen oksida. Sterilisasi gas berjalan lambat waktu sterilisasi tergantung pada keberadaan kontaminasi kelembaban, temperatur dan konsentrasi etilen oksida. Konsentrasi minimum etilen oksida dalam 450 mg/L, 271 Psi, konsentrasi ini 85°C dan 50% kelembaban relatif dibutuhkan 4-5 jam pemaparan. Di bawah kondisi sama 1000 mg/L membutuhkan sterilisasi 2-3 jam. Dalam pensterilan digunakan bahan kimia dalam bentuk gas atau uap, seperti etilen oksida, formaldehid, propilen oksida, klorin oksida, beta propiolakton, metilbromida, kloropikrin. Digunakan untuk sterilisasi bahan yang termolabil seperti bahan biologi, makanan, plastik, antibiotik. Aksi antimikrobialnya adalah gas etilen oksida mengadisi gugus –SH, -OH, -COOH,-NH2 dari protein dan membentuk ikatan alkilasi sehingga protein mengalami kerusakan dan mikroba mati.
Faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengsterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas.
5. Sterilisasi dengan Radiasi
Sterilisasi dengan radiasi digunakan untuk bahan/produk dan alat-alat medis yang peka terhadap panas (termolabil) dan jika residu etilen oksida tidak diharapkan. Pengukuran presisi dari dosis radiasi, yang tidak berhubungan dengan suhu, adalah merupakan faktor kontrol dalam sterilisasi radiasi selama dengan waktu radiasi. Monitoring dan kotrol proses sangat sederhana, tetapi kehati-hatian akan keamanan harus dilakukan oleh operator sterilisasi. Prinsip sterilisasi radiasi adalah radiasi menembus dinding sel dengan langsung mengenai DNA dari inti sel sehingga mikroba mengalami mutasi. Ada dua macam radiasi yang digunakan yakni gelombang elektromagnetik (sinar x, sinar γ) dan arus partikel kecil (sinar α dan β).

C. ALAT DAN BAHAN
• Alat :
– Autoclave
– Oven
• Bahan :
– Erlenmeyer            – Gunting
– Tabung reaksi        – Kertas label
– Cawan petri            – Benang Kasur
– Botol media            – Aluminium foil
– Gelas ukur               – Media (Nutrien Agar dan Nutrien Broth)
– Labu takar               – Kapas
– Kaki tiga                   – Batang pengaduk
– Kasa asbes               – Spatel
– Stirrer                       – Hot Plate

D. PROSEDUR KERJA DAN DATA PENGAMATAN
1. Persiapan dan Sterilisasi Alat
Alat-alat yang akan disterilisasi dicuci dan dikeringkan.

Alat-alat yang mempunyai mulut ditutup dengan kapas berlemak, seperti: tabung reaksi, Erlenmeyer, botol media, gelas ukur, labu takar, dan pipet.

Caranya :
Sepotong kapas dilipat kedua ujungnya membentuk segi empat sebesar mulut alat.

Kapas digulung silinder cukup padat.

Bungkus dengan kain kasa, masukkan ke dalam mulut alat sedalam 2/3.

Khusus Pipet
Tutup kapas dimasukkan dengan sebatang kawat.

Kapas yang terurai keluar dari mulut pipet dihilangkan dengan melewatkan mulut pada api bunsen.

Kapas penutup ditutup aluminium foil/bahan lain, bila perlu diikat dengan benang kasur.

Alat yang permukaannya harus steril ditutup aluminium foil satu per satu.

Cawan petri dibungkus seluruhnya dengan aluminium foil/kertas bekas bersih (bukan koran).

Alat-alat gelas yang tidak presisi.

Disterilisasi dengan oven, suhu: 170 ℃; waktu 1 jam.

Alat-alat yang presisi.

Disterilisasi dengan autoclave, suhu: 121 ℃; waktu 15-20 menit.

Alat-alat dikeringkan dalam oven pengering, suhu :70 ℃; waktu 30 menit.

2. Pembuatan dan Sterilisasi Media serta Larutan Pengencer
Nutrient agar ditimbang untuk pembuatan 250 ml dan Nutrien Broth untuk pembuatan 150 ml.

Masing-masing media dimasukkan dalam Erlenmeyer yang sudah ditandai.

+ akuades, panaskan di atas nyala api bunsen sambil di aduk sampai larutan jernih.

Dituang dalam botol media dan ditutup kapas serta aluminium foil.

Diikat benang kasur dan diberi etiket (tanggal pembuatan, nama media, dan nama pembuat).

Disterilisasi dengan autoclave.

Didinginkan pada suhu kamar.

Dimasukkan dalam lemari pendingin untuk disimpan.

Kondisi media diamati dan dicatat dengan melihat kejernihan, pengamatan dilakukan 24 jam.

Hasil Pengamatan
Nutrien agar = berwarna salem (coklat muda), berbentuk serbuk kasar seperti granul dan agak berbau.
Berat nutrien agar = 10,05 gr+Aquades = 500 ml –> Larutan berubah warna menjadi kuning tua keruh.
Dipanaskan pada suhu 315 ℃, larutan menjadi berwarna kuning tua jernih.

Nutrien Broth = berwarna kuning, berbentuk serbuk halus.
Berat nutrien Broth = 3,9150 gr+Aquades 300 ml         Larutan berubah warna menjadi kuning keruh.
Dipanaskan pada suhu 250 ℃, larutan menjadi berwarna kuning jernih.

Nutrien agar berubah bentuk menjadi seperti agar (kenyal/gel) berwarna kuning tua.
Nutrien Broth berubah warna menjadi salem bening.

Nutrien agar = tidak ada lendir yang tumbuh pada media.
Nutrien Broth = tidak ada jamur yang tumbuh pada media.

E. PERHITUNGAN
Untuk pembuatan Nutrien Agar dan Nutrien Broth, dikarenakan dilakukan untuk 2 kelompok maka komposisinya dikalikan 2. Sehingga :
Nutrien Agar = 250 ml x 2 = 500 ml
500 ml x 20 gr = 10 gr
1000 ml
Nutrient Broth = 150 ml x 2 = 300 ml
300 ml x 13 gr = 3,9 gr
1000 ml

F. PEMBAHASAN
Pada percobaan kali ini dilakukan sterilisasi alat-alat yang berada di laboratorium mikrobiologi. Tujuan dilakukannya sterilisasi alat ialah agar alat-alat yang berada di laboratorium tidak terkontaminasi dengan mikroorganisme yang ada di lingkungan sekitar. Alat- alat yang disterilisasi yaitu tabung reaksi, labu ukur, labu takar, labu Erlenmeyer, pipet volume, dan cawan petri. Alat-alat yang disterilisasi menggunakan autoclave merupakan alat-alat gelas yang presisi. Dalam sterilisasi uap (panas lembab) menggunakan autoclave  dengan membutuhkan  waktu yang sangat singkat untuk mensterilkan alat dan pada suhu 121℃, karena alat gelas tidak akan memuai sehingga tidak akan merubah ukuran alat. Sedangkan jika menggunakan oven dalam sterilisasi uap  membutuhkan waktu yang lama yaitu 1-2 jam dan membutuhkan suhu yang tinggi 160-170 ℃. Karena pada suhu 160-170 ℃, alat gelas akan memuai sehingga dapat merubah ukuran alat. Sebelum alat-alat gelas disterilisasikan menggunakan autoclave, semua alat ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi alumunium foil. Tujuannya yaitu semua alat yang disterilisasi benar-benar steril dari mikroba agar tidak ada lagi spora mikroba yang masuk.
Percobaan selanjutnya adalah pembuatan dan sterilisasi media serta larutan pengencer. Media yang digunakan adalah Nutrien Agar dan Nutrien Broth. Nutrien Agar adalah medium umum untuk uji air dan produk pangan. Nutrien juga digunakan untuk pertumbuhan dari mikroorganisme yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton dan agar. Lalu Nutrien Broth adalah media untuk mikroorganisme yang berbentuk cair. Kegunaan dari Nutrien Broth tidak jauh berbeda dengan Nutrien Agar. Pembuatan media Nutrien Broth dilakukan terlebih dahulu karena Nutrien Broth tidak mengandung agar sehingga dapat mudah larut dalam aquades dan waktu yang dibutuhkan untuk melarutkan Nutrien Broth sangat cepat.
Untuk membuat media Nutrien Broth dibutuhkan 3,9150 gram Nutrien Broth dan 300 ml aquades. Nutrien Broth lalu dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning keruh. Warna kuning keruh ini berarti larutan masih belum steril. Lalu larutan Nutrien Broth dipanaskan menggunakan hot plate. Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetik stirrer yang bertujuan agar Nutrien Broth larut sempurna dan menghasilkan larutan berwarna kuning yang jernih. Setelah dilakukan pemanasan, labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil. Sedangkan untuk membuat media Nutrien Agar dibutuhkan 10,05 gram Nutrien Agar dan 500 ml aquades. Nutrien agar dilarutkan dengan aquades dan menghasilkan larutan yang berwarna kuning tua keruh. Warna kuning tua keruh ini berarti larutan masih belum steril, setelah itu Nutrien Agar dipanaskan juga menggunakan hot plate . Pemanasan dilakukan sambil diaduk menggunakan magnetik stirrer yang bertujuan agar Nutrien Agar larut sempurna dan menghasilkan larutan berwarna kuning tua jernih. Setelah dilakukan pemanasan, labu Erlenmeyer ditutup dengan kapas yang dibungkus kain kasa dan dilapisi dengan menggunakan alumunium foil. Tujuan ditutup kapas dan alumunium foil agar proses sterilisasi media Nutrien Broth berjalan lancar dan menghasilkan media Nutrien Broth yang benar-benar steril. Setelah itu labu Erlenmeyer dimasukkan kedalam autoclave dengan suhu 121℃ selama 15 menit. Setelah 15 menit, labu dikeluarkan dari autoclave dan menghasilkan larutan Nutrien Broth yang berwarna kuning jernih sama dengan warna larutan Nutrien Broth sebelum dimasukkan kedalam autoclave. Setelah itu larutan Nutrien broth didiamkan selama 24 jam di laboratorium. Pendiaman ini dilakukan karena mikroba atau bakteri dapat berkembang biak dengan cepat dalam waktu 24 jam.
Tujuan dilakukan membuat media dari Nutrien Agar dan Nutrien Broth adalah untuk biakan jamur pada Nutrien Agar, dan sebagai media pertumbuhan bakteri pada Nutrien Broth. Dari percobaan yang telah dilakukan ternyata hasil yang diperoleh dari media Nutrien Agar tidak terdapat bakteri yang berupa lendir pada bagian atas media dan pada Nutrien Broth tidak terdapat jamur yang tumbuh di sekitar mulut tabung. Hal ini di sebabkan karena alat-alat yang dipakai masih steril, sedangkan jika terdapat bakteri dan jamur pada media alat-alat yang dipakai sudah dalam kondisi tidak steril lagi.

G. KESIMPULAN
• Sterilisasi adalah suatu proses penghancuran secara lengkap semua mikroba hidup dan spora-sporanya.
• Ada 5 metode umum sterilisasi, yaitu : sterilisasi uap (panas lembab), sterilisasi panas kering, sterilisasi dengan penyaringan (filtrasi), sterilisasi gas, sterilisasi dengan Radiasi.
• Prinsip penggunaan autoclave di dasarkan pada mikroorganisme termasuk spora yang tahan panas, mudah terbunuh dengan panas lembab pada temperatur sedikit di atas titik didih air.
• Media Nutrien Agar dan Nutrien Broth hasil yang diperoleh tidak terdapat bakteri maupun jamur di karenakan alat-alat yang dipakai masih steril.

H. DAFTAR PUSTAKA
Validation of Pharmaceutical Processes (electronic version). James Agalloco. 2008. USA : Informa Healthcare Inc.
Scoville’s : The Art of Compounding, Glenn L. Jenkins et.all. 1957. New York : MC-Graw Hill Book Companies.
Remington’s Pharmaceutical Sciences 18 th Edition. A.R. Gennaro. 1990. Pennsylvania : Mack Publishing Company.
Pharmaceutical Technology. Eugene L. Parrot. 1974. Minneapolis : Burgess Publishing Company.
http://www.scribd.com/doc/16574529/petunjuk-praktikum-mikpl_sharing_status_hidden=1robiologi-dasar. Di akses tanggal 17 Oktober 2010 08.00 Am.

About these ads
Komentar
  1. rade mengatakan:

    sangat membantu trimakasih

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s