KINETIKA REAKSI ENZIM

Posted: 11 Oktober 2012 in all about my task

Tujuan :
Dapat memahami kinetika reaksi enzim dan faktor-faktor yang mempengaruhi kondisi optimum suatu enzim.

Teori Dasar
Enzim merupakan protein yang mengkatalisis reaksi biokimia yang secara bersama-sama membentuk metabolisme perantara dari sel, berfungsi untuk mempercepat jalannya reaksi metabolisme di dalam tubuh tanpa mempengaruhi keseimbangan reaksi. Enzim bekerja dengan urutan yang teratur, dapat mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi yang menyimpang dan mengubah energi kimiawi serta yang membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana. Kerja enzim yaitu menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia tanpa mengubah keseluruhan perubahan energi bebas reaksi atau letak kesetimbangan akhir, serta meningkatkan fraksi molekul dalam kumpulan molekul tertentu untuk lebih cepat bereaksi per satuan waktu dibandingkan dengan keadaan tanpa katalisator. Selama dalam siklus katalitik, enzim akan bergabung dengan substrat.
Salah satu sifat enzim yaitu ikut bereaksi, tetapi pada akhir reaksi akan didapatkan kembali dalam bentuk semula. Hal tersebut mengakibatkan enzim dapat dipakai kembali setelah melaksanakan aktivitasnya, sehingga tubuh kita tidak membutuhkan enzim dalam jumlah yang besar. Jumlah atau kadar enzim yang kecil tersebut menimbulkan kesulitan tersendiri bagi kita untuk mengukur kadar enzim, sehingga memerlukan teknik yang rumit. Secara klinis pengukuran kadar enzim sangat penting dilakukan. Disamping untuk mengetahui kadar suatu enzim pada seorang penderita, enzim plasma nonfungsinal dapat dijadikan sebagai pertanda adanya kerusakan organ tertentu. Pengukuran kadar enzim dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu:
Dibandingkan dengan enzim murni.
Dilakukan dengan membandingkan enzim yang ingin diukur kadarnya dengan enzim murni yang sudah diketahui kadarnya. Kadar enzim dinyatakan dengan satuan µg. Contoh misalnya enzim murni dengan kadar 2 ug dapat mengkatalisis substrat dengan jumlah tertentu selama 10 detik. Jika memakai enzim yang ingin diukur kadarnya membutuhkan waktu 20 detik, maka kadar enzim yang bersangkutan adalah 1 ug. Pengukuran dengan cara diatas, jelas membutuhkan tersedianya enzim murni. Kenyataannya banyak enzim yang belum tersedia bentuk murninya.
Mengukur kecepatan reaksi yang dikatalisisnya.
Satuan enzim dinyatakan dalam unit, kadarnya diukur berdasarkan jumlah substrat yang bereaksi atau produk yang terbentuk per satuan waktu. Satu unit internasional disepakati sebagai jumlah enzim yang diperlukan untuk mengkatalisis pembentukan 1 µmol produk per menit pada kondisi tertentu. Pengukuran aktifitas enzim dapat pula dilakukan menggunakan alat spektrofotometer. Contoh misalnya aktifitas enzim dehidrogenase yang bergantung NAD+ diperiksa secara spektofotometris dengan mengukur perubahan absorbsinya pada 340 nm yang menyertai oksidasi atau reduksi NAD+ atau NADPH. Oksidasi NADH menjadi NAD+ terjadi disertai dengan penurunan densitas optik (OD, optical density) pada 340 nm, yang proporsional dengan jumlah NADH yang dioksidasi. Demikian pula, kalau NAD+ direduksi, OD pada 340 nm akan meningkat sebanding dengan jumlah NADH yang terbentuk. Perubahan OD pada 340 nm ini dapat dimanfaatkan bagi pemeriksaan analisis kuantitatif setiap enzim dehidrogenase yang bergantung NAD+ atau NADP+. Bagi enzim dehidrogenase yang mengatalitis oksidasi NADH oleh substratnya yang teroksidasi, kecepatan penurunan OD pada 340 nm akan berbanding lurus dengan konsentrasi enzim. Oleh karena itu, hasil pengukuran kecepatan penurunan OD pada 340 nm memungkinkan kita menyimpulkan kuantitas enzim.

Kecepatan reaksi enzimatik dapat diukur dengan mengukur jumlah substrat yang diubah atau produk yang dihasilkan per satuan waktu, dan pada suatu waktu yang sangat pendek, atau pada satu titik tertentu pada grafik diatas disebut kecepatan sesaat (instantaneus velocity). Kecepatan sesaat merupakan tangens dari garis singgung terhadap grafik pada suatu titik tertentu. Kecepatan sesaat pada waktu mendekati nol, yaitu saat grafik masih berupa garis lurus disebut kecepatan awal (Vo). Pada reaksi enzimatis, jika disebut kecepatan, umumnya yang dimaksud adalah kecepatan awal. Hal ini disebabkan karena pada keadaan awal reaksi, kita dapat mengetahui kondisi/ keadaan dengan lebih tepat. Disamping kecepatan sesaat dan Vo, juga dikenal istilah kecepatan rata-rata, yaitu perbandingan antara perubahan jumlah substrat terhadap waktu.

Faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatik :
1. Suhu
2. pH
3. Kadar enzim
4. Kadar substrat
5. Aktivator
6. Inhibitor
Reaksi enzimatik :

Keterangan : E : Enzim
S : Substrat
P : Produk
Reaksi enzimatik berlangsung melalui pembentukan kompleks enzim substrat (ES), bila semua enzim dalam keadaan ES (sistem jenuh oleh substrat) maka laju reaksi akan mencapai nilai maksimum (Vmaks). Kinetika enzim menginvestigasi bagaimana enzim mengikat substrat dengan mengubahnya menjadi produk. Data laju yang digunakan dalam analisa kinetika didapatkan dari asai enzim.
Aktivitas enzim akan meningkat bersamaan dengan peningkatan suhu, laju berbagai proses metabolisme akan naik sampai batasan suhu maksimal. Prinsip biologis utama adalah homeostatis, yaitu keadaan dalam tubuh yang selalu mempertahankan keadaan normalnya. Perubahan relatif kecil saja dapat mempengaruhi aktivitas banyak enzim. Adanya inhibitor non kompetitif irreversibel dan antiseptik dapat menurunkan aktivitas enzim. Kecepatan reaksi mula-mula meningkat dengan menaiknya suhu, hal ini disebabkan oleh peningkatan energi kinetik pada molekul-molekul yang bereaksi. Akan tetapi pada akhirnya energi kinetik enzim melampaui rintangan energi untuk memutuskan ikatan hidrogen dan hidrofobik yang lemah, yang mempertahankan struktur sekunder-tersiernya. Pada suhu ini terjadi denaturasi enzim menunjukkan suhu optimal. Sebagian besar enzim suhu optimalnya berada diatas suhu dimana enzim itu berada.
Ada dua metode analisis kuantitatif kinetika reaksi enzim, yaitu asas keseimbangan Michaelis-Menten dan asas teori keadaan tunak (steady state theory) Briggs-Haldone. Persamaan Michaelis-Menten merupakan persamaan kecepatan reaksi enzimatik substrat tunggal yang menyatakan hubungan kuantitatif kecepatan reaksi awal (Vo), kecepatan reaksi maksimum (Vmaks), konsentrasi substrat [S], dan konstanta Michaelis-Menten [KM].

Persamaan reaksi Michaelis-Menten :
(Km=(K2+K3))/K1

Keterangan : Vo = kecepatan reaksi awal
Vmaks = kecepatan reaksi maksimum
[S] = konsentrasi substrat
[KM] = konstanta Michaelis-Menten

Persamaan Briggs-Haldone menyatakan dimana laju reaksi pembentukan kompleks ES sama dengan laju reaksi penguraian ES menjadi P dan E yang akan menghasilkan persamaan yang sama untuk hubungan laju reaksi enzim dengan konsentrasi substrat.

Persamaan reaksi Briggs-Haldone :
(Vo=Vmax .[S])/([S]+ Km)

Persamaan Michaelis-Menten dapat diturunkan secara aljabar menjadi bentuk lain menjadi persamaan Lineweaver-Burk karena dapat menghasilkan penentuan Vmaks secara lebihtepat yang hanya dapat diduga pada pemetaan V0 terhadap [S].

Alat dan Bahan
Alat :
- Stopwatch
- Tabung reaksi
- Pengaduk gelas
- Pipet ukur 1 ml, 5 ml, dan 10 ml
- Pipet tetes
- Water bath 35℃
- Kertas saring
- Kuvet
- Spektrofotometer
- Corong kaca

Bahan :
- Larutan TCA 20 %
- Larutan Kasein 2% (b/v)
- Larutan dapar fosfat 0,1 M; pH 8,0
- Larutan NaOH 0,5 N
- Aquadest
- Reagen Folin-Ciocalteu
- Larutan tripsin ( 10 mg tripsin dalam 25 ml dapar fosfat 0,1 M; pH 8,0 )

Prosedur percobaan
Tabung t = 0 menit
Larutan buffer fosfat + tripsin

⊕ 3 ml larutan TCA 20%
diaduk
Inkubasi 30 menit dalam water bath 35℃

⊕ larutan kasein sesuai label

Diamkan 20 menit dalam air es

Di sentrifuga 10 menit

Di saring untuk di ambil supernatannya

Filtrat diperlakukan lebih lanjut menurut Metode Anson

Tabung t = 20 menit
Kasein dalam tabung reaksi yang sesuai table diinkubasi 5 menit dalam water bath 35℃
diaduk perlahan ( jangan sampai berbusa )
⊕ larutan buffer fosfat dan larutan tripsin berturut-turut

Diinkubasi tepat 20 menit dalam incubator 35℃

Dihitung setelah penambahan tripsin
Reaksi dihentikan
⊕ 3 ml TCA 20% ke dalam tabung
diaduk kuat
Didiamkan 20 menit dalam air es, untuk menyempurnakan pengendapan

Di sentrifugasi 10 menit
disaring
Diambil supernatannya

Filtrat diperlakukan lebih lanjut dengan Metode Anson

Metode Anson
2 ml TCA-Filtrat di atas + 4 ml NaOH 0,5 M

⊕ 1 ml larutan Folin-Ciocalteu ( 1 volume reagen + 1 volume aquadest hingga mengandung 1 N asam )

Didiamkan 10 menit

Serapannya ditetapkan pada 650 nm ( pengukuran harus dilakukan tepat setelah 10 menit ).
Pengolahan Data
- Absorbansi (A)
∆ A = At20-At0
∆ t = t20-t0
v= ∆ A
∆ t
s=(aliquot) x 2%
Vtot.
Grafik dibuat yang menggambarkan 1/V terhadap 1/S (grafik Lineweaver-Burk) dan tentukan nilai Vmax. dan Km.

Data Pengamatan
Tabung t = 0 menit
Buffer fosfat + tripsin + TCA 20% : Larutan tidak ada perubahan warna, tetap warna bening. Diinkubasi tidak ada perubahan+ kasein 20% : larutan berwarna bening dan terdapat endapan kasein di atas permukaan tabung. Diaduk larutan berwarna putih, endapan menyebar. air es : larutan berwarna bening dan endapan terdapat pada bawah tabung. Disentrifuga :endapan menempel di dinding tabung reaksi. Filtrat berwarna putih bening.

Tabung t = 20 menit
Kasein : berwarna putih keruh ada endapan
Tabung 1 : kasein diinkubasi tidak ada perubahan diaduk + Buffer fosfat + tripsin larutan tetap tidak berubah. diinkubasi larutan menjadi bening. + TCA 20% larutan berwarna bening. Air es larutan tetap berwarna bening tidak berubah.
Tabung 2 : kasein diinkubasi tidak ada perubahan diaduk + Buffer fosfat + tripsin larutan menjadi berwarna putih keruh dan ada endapan putih. + TCA 20% larutan menjadi bening dan terdapat sedikit endapan. Air es larutan menjadi keruh dan terdapat agak banyak endapan.
Tabung 3 : kasein diinkubasi tidak ada perubahan diaduk + Buffer fosfat + tripsindiinkubasi larutan berwarna putih keruh. + TCA 20% larutan berwarna bening dan terdapat banyak endapan. Air es larutan menjadi keruh dan terdapat agak banyak endapan.
Tabung 4 : kasein diinkubasi tidak ada perubahan diaduk + Buffer fosfat + tripsindiinkubasi larutan berwarna putih keruh. + TCA 20% larutan berwarna bening dan terdapat sedikit endapan. Air es larutan menjadi keruh dan terdapat sedikit endapan.
Tabung 5 : kasein diinkubasi tidak ada perubahan diaduk + Buffer fosfat + tripsindiinkubasi + TCA 20% larutan berwarna keruh dan terdapat banyak endapan. Air es larutan menjadi keruh dan terdapat banyak endapan .

Metode Anson
No. Tabung Tripsin (ml) Kasein (ml) Buffer fosfat (ml)
t = 0 1 0,1 5,9
t = 20 1 0,1 5,9
t = 0 1 0,5 5,5
t = 20 1 0,5 5,5
t = 0 1 1,0 5,0
t = 20 1 1,0 5,0
t = 0 1 3,0 3,0
t = 20 1 3,0 3,0
t = 0 1 5,0 1,0
t = 20 1 5,0 1,0

2 ml TCA Filtrat + NaOH larutan tidak terjadi perubahan. + 1 ml Folin-Ciocalteu larutan berwarna hijau muda bening, setelah didiamkan dispektrofotometer

t = 0
Tabung Absorbansi nm
1 0,03 ABS
2 0,07 ABS
3 0,015 ABS
4 0,374 ABS
5 0,053 ABS

t = 20
Tabung Absorbansi nm
1 0,108 ABS
2 0,207 ABS
3 0,214 ABS
4 0,158 ABS
5 0,151 ABS

Perhitungan
π=650 nm
ΔA = At20 – At0
ΔA1 = 0,108 – 0,03 = 0,078
ΔA2 = 0,207 – 0,07 = 0,137
ΔA3 = 0,214 – 0,015 = 0,199
ΔA4 = 0,158 – 0,374 = – 0,216 ; dimutlakan jadi 0,216
ΔA5 = 0,151 – 0,053 = 0,098

Δt = t20-t0
= 20-0
= 20

V = ΔA
Δt
V1 = 0,078 = 3,9 x 10-3
20
V2 = 0,137 = 6,85 x 10-3
20
V3 = 0,199 = 9,95 x 10-3
20
V4 = 0,216 = 1,08 x 10-2
20
V5 = 0,098 = 4,9 x 10-3
20

S = aliquot x 2% aliquot: bagian kecil yang diambil dari substrat.
Vtotal
S1 = 0,1 x 2% = 0,00028 = 2,857 x 10-4
7
S2 = 0,5 x 2% = 0,0014 = 1,428 x 10-3
7
S3 = 1,0 x 2% = 0,0028 = 2,857 x 10-3
7
S4 = 3,0 x 2% = 0,0085 = 8,571 x 10-3
7
S5 = 5,0 x 2% = 0,014 = 1,42 x 10-2
7
Perhitungan nilai Vmaks dan Km
Persamaan Lineweaver-Burk : y = mx + b
1/V = Km/Vmaks x 1/[S] + 1/Vmaks
Diperoleh dari persamaan grafik : y = 0,0436x + 105,24
Jadi, Vmaks :
1/Vmaks = 105,24
Vmaks = 1/105,24
Vmaks = 0,0095021 = 9,5021 x 10-3

Grafik
Di lembaran terpisah setelah kesimpulan.

Pembahasan
Dalam percobaan kinetika reaksi enzim substrat yang digunakan adalah kasein dan enzimnya adalah enzim tripsin yang terdapat pada usus dua belas jari (duodenum). Didalam usus, protein akan dihidrolisis oleh tripsin. Fungsi enzim tripsin yaitu untuk mereaksikan substrat.
Pada percobaan t = 0 dan t = 20, dilakukan penambahan buffer fosfat yang bertujuan mengaktifkan kerja enzim dan untuk mempertahankan pH, karena enzim bekerja pada pH optimum. pH optimum enzim tripsin adalah 8,0. Lalu penambahan TCA 20% untuk dapat menghentikan jalannya reaksi kerja enzim dengan cara mendenaturasi protein sehingga enzim tidak dapat bekerja lagi.
Fungsi t = 0 yaitu agar enzim tidak dapat bekerja lagi walaupun terus menerus di tambahkan substrat. Larutan-larutan substrat dan enzim yang direaksikan diinkubasi dalam water bath terlebih dahulu agar dapat bekerja pada suhu yang optimum serta enzim dapat mengkatalis substrat, tetapi jika terlalu tinggi suhunya > 40 ℃ pada water bath enzim akan menjadi rusak sehingga tidak dapat mengkatalisis. Jika terlalu rendah suhunya enzim menjadi tidak aktif, sehingga enzim tidak dapat bekerja. Biasanya suhu optimum enzim untuk bekerja adalah 30 ℃, minimalnya 0 ℃. Kemudian dimasukkan dan didiamkan pada air es untuk menurunkan kelarutan suatu larutan, sehingga akan menyebabkan terbentuknya endapan. Maka endapan yang terbentuk akan semakin besar.
Fungsi sentrifugasi yaitu untuk memisahkan partikel koloid, dalam percobaan dilakukan untuk memisahkan endapan dari campuran larutan sehingga akan didapatkan filtrat yang jernih. Sentrifugasi dilakukan berdasarkan prinsip dasar memisahkan partikel koloid dari endapan. Perbedaan t = 0 dan t = 20 yaitu :
t = 0 : dari awal kerja enzim sudah di non-aktifkan atau dihentikan.
t = 20 : enzim bekerja selama 20 menit.
Pada percobaan t = 20 dilakukan penambahan TCA 20% setelah 20 menit yang berfungsi memberhentikan reaksi kerja enzim dalam mengkatalis substrat. Enzim dan substrat sudah bekerja, enzim mengkatalisis kasein (substrat) dan diberhentikan oleh TCA. Sedangkan inkubasi dilakukan untuk mengoptimalkam kerja enzim dimana enzim dapat mengkatalisis substrat. Campuran dari filtrat yang sudah ada TCA ditambahkan NaOH bersifat basa, untuk menetralkan larutan TCA, karena TCA bersifat asam sehingga larutan sifatnya menjadi netral.
Pada metode Anson, penambahan larutan Folin-Ciocalteu dilakukan untuk mengetahui hasil absorban pada spektrofotometer dimana Folin-Ciocalteu berfungsi untuk membentuk senyawa berwarna, sehingga dapat diukur nilai absorban dalam spektrofotometer. Spektro visible digunakan untuk reaksi yang berwarna. Ukuran spektro visible biasanya 600 nm dari 380 nm – 700 nm.

Kesimpulan
Enzim merupakan protein yang mengkatalisis reaksi biokimiasecara kolektif membentuk metabolism perantara dari sel. Fungsinya adalah untuk mempercepat reaksi.
Ananlisis kuantitatif kinetika reaksi enzim dilakukan atas dua asas, yaitu asas keseimbangan Michaelis-Menten dan asas teori keadaan tunak (steady state theory) Briggs-haldone.
Persamaan reaksi Michaelis-Menten :
(Vo=Vmax .[S])/([S]+ Km)

Persamaan reaksi Briggs-Haldone :
(Km=(K2+K3))/K1

Daftar Pustaka
Anonima. http://klinikdokterhairrudin.blogspot.com/2008/10/kinetika-enzim_14.html. Diakses pada tanggal 31 Oktober 9:46 AM.
Anonima. http://filzahazny.wc/2009/07/20/enzim-2/.html. Diakses pada tanggal 01 Desember 2010 9:37 PM.
Anonima. http://lihatdarisini.blogspot.com/2009_10_01_archive.html. Diakses pada tanggal 12 Desember 2010 9:14 PM.
Wirahadikusumah, M. 1989. Biokimia : Protein, Enzim, dan Asam nukleat. Bandung : ITB.
Poedjiadi, Anna. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : UI Press.
Murrey, Robert K. 2002. Biokimia, Jakarta : Harper Ecg.
Winarno, F.G. 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta : PT. Gramedia Pustaka.

Tinggalkan Balasan

Isikan data di bawah atau klik salah satu ikon untuk log in:

WordPress.com Logo

You are commenting using your WordPress.com account. Logout / Ubah )

Twitter picture

You are commenting using your Twitter account. Logout / Ubah )

Facebook photo

You are commenting using your Facebook account. Logout / Ubah )

Google+ photo

You are commenting using your Google+ account. Logout / Ubah )

Connecting to %s